貨號(hào)：A104-5
規(guī)格：10T（50μl）×5支
保存：-20℃避光保存兩年
【產(chǎn)品概述】
基于重組原理的無(wú)縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴于繁瑣的酶切、回收、連接等操作，通過(guò)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組，可將DNA片段克隆至任意線性化載體任意位點(diǎn)，載體自連背景極低。無(wú)縫克隆技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。Seamless Cloning and Assembly Kit作為升級(jí)版的無(wú)縫克隆及多片段重組試劑盒，一個(gè)反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)DNA片段的重組，且陽(yáng)性率高于95%。
【適用范圍】
基因定向克隆，多片段重組。
【實(shí)驗(yàn)流程】

【ExonArt Seamless Cloning and Assembly試劑盒實(shí)驗(yàn)方案】
1. 線性化載體制備
采用酶切或反向PCR擴(kuò)增方法將載體線性化。
a. 酶切制備：
選擇合適的位點(diǎn)，單酶切或雙酶切皆可。若使用單酶切進(jìn)行線性化，可以適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。酶切完成后，應(yīng)將限制性內(nèi)切酶失活或?qū)€性化載體純化后再用于重組反應(yīng)。
注1 : 載體酶切一定要完全，否則未切開(kāi)的載體會(huì)影響后續(xù)陽(yáng)性克隆的鑒定；
注2 : 經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化無(wú)需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化。
b. 反向PCR擴(kuò)增制備
為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真的聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用線性化質(zhì)粒做模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對(duì)后續(xù)陽(yáng)性克隆的鑒定。
注：如果使用環(huán)狀質(zhì)粒做模板，應(yīng)使用DpnI對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行降解，再用于后續(xù)重組反應(yīng)。
2. 插入片段PCR引物設(shè)計(jì)
PCR引物的5′ 端必須包含與其相鄰片段（其他插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦使用20 nt）序列。
插入片段正向擴(kuò)增引物：
5′-載體上游末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選）+基因特異性正向配對(duì)序列-3′
插入片段反向擴(kuò)增引物：
3′- 基因特異性反向配對(duì)序列+酶切位點(diǎn)（可選）+載體下游末端同源序列-5′

注：盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆，當(dāng)酶切位點(diǎn)25 nt區(qū)域內(nèi)含量為40~60%
時(shí)，重組效率最高。

3. 插入片段PCR擴(kuò)增

推薦使用高保真的聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)。若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積應(yīng)不超過(guò)總反應(yīng)體積的20%。

4. 重組反應(yīng)：

配制以下反應(yīng)體系

組分	反應(yīng)體系
Seamless Cloning and Assembly kit	5 μl
線性化載體	50~200 ng
插入片段	10~200 ng
Sterilized ddH2O	補(bǔ)足至10 μl

重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吹打混勻各組分后進(jìn)行瞬時(shí)離心，避免氣泡產(chǎn)生，切勿渦旋。

注1 : 插入片段與載體在重組時(shí)為相同摩爾數(shù)；

注2 : 若插入片段的長(zhǎng)度小于200 bp，則插入片段與載體的摩爾比應(yīng)調(diào)整為5:1；

注3 : 當(dāng)1~2個(gè)DNA片段插入載體時(shí)，DNA總量推薦為0.02~0.5 pmols；當(dāng)4~6個(gè)DNA片段插入載體時(shí)，DNA總量推薦為0.2~1 pmols；

注4 : DNA摩爾數(shù)與質(zhì)量換算公式：pmols=(weight in ng)×1000/(base pairs×650 daltons) ；例如，200 ng的5000 bp載體為0.06 pmols；

注5 : 載體片段過(guò)長(zhǎng)、插入片段過(guò)長(zhǎng)或片段數(shù)過(guò)多，克隆數(shù)及陽(yáng)性克隆率均會(huì)降低。

1. 將反應(yīng)體系置于50℃，反應(yīng)15~60 min。

注1：推薦使用PCR儀等溫控比較精確的儀器進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間不足或過(guò)長(zhǎng)均會(huì)影響克隆效率；

注2：插入片段小于500 bp時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間為15 min；

注3：插入片段在4 kb以上時(shí)，建議反應(yīng)時(shí)間為45~60 min；

注4：插入3~5個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間為45~60 min。

1. 重組反應(yīng)完成后，將反應(yīng)體系進(jìn)行瞬時(shí)離心，置于冰上冷卻，用于轉(zhuǎn)化或者凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/li>

注：-20℃凍存的重組產(chǎn)物，建議在1周內(nèi)使用。

5. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取5~10 μl重組產(chǎn)物，加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，緩慢吹打混勻，冰上放置30 min。42℃熱激90 sec，冰上放置3 min，加800 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45~60 min。將菌液均勻涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素的平板上，倒置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

注：不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆數(shù)及克隆陽(yáng)性率有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率大于10⁸ CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞。

【常見(jiàn)問(wèn)題】

1.轉(zhuǎn)化效率低：感受態(tài)效率低下；DNA片段純度不夠；重組反應(yīng)抑制物；DNA片段比例不佳。

2.克隆陽(yáng)性率低：載體線性化不完全；相同抗性質(zhì)粒污染；平板抗性不足。

3.大量克隆含有不正確的插入片段：非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

【備注】

本產(chǎn)品僅供科研使用。在確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，本公司承諾為客戶免費(fèi)更換等量的合格產(chǎn)品。 在所有情況下，本公司對(duì)此產(chǎn)品所承擔(dān)的責(zé)任，僅限于此產(chǎn)品的價(jià)值本身。